ЧТО ТАКОЕ ГЕН?
Доклад Натальи Николаевны Вастеровой на студенческом семинаре У курса.
Куратор Сергей Васильевич Шестаков.
11.12.72
Что такое ген?
Ген – это понятие формальной генетики (менделизма), придуманное человеком для объяснения реальных событии. Мендель предложил этот термин (точнее, соответствующий ему «фактор») для объяснения результатов скрещивания гороха.
Ген – это универсальное понятие, обозначающее нечто, кодирующее наследуемые признаки. До сих пор в природе не существовало материальной единицы, воплощающей это понятие. Т.о. для каждого признака, который передается в череде поколений, придумываем некоторый фактор, существующий в клетке, и называем его геном.
При такой постановке вопроса термин «ген», хотя и введенный строго формально, многие исследователям кажется чем-то мифическим. Но к этому вопросу мы вернемся позже, когда произведем теоретическое обобщение.
А вначале я расскажу вам две работы, необходимые для того, чтобы показать строго реальное существование гена. Это работы по выделению гена.
Первая работа – W.Colli & M.Oishl, «A Procedure for Gene Purification: The Purification of the Ribosomal RNA Genes of Bacillus subtills as DNA – RNA Hybrids», J. molecular Biology, 51: 657-669, 1970.
Как вы видите по названию, авторы из огромного числа генов в геноме Bacillus subtills выбрали именно ген рибосомальной РНК. Для этого существуют три причины.
Первая причина состоит в следующем, Для р-РНК впервые был доказан тот факт, что РНК кодируется непосредственно на ДНК. Интересно, что этот факт имеет самостоятельное теоретическое значение. Получен он был в работе Шпигельмана и является прямым доказательством того, что является материальным носителем генетической информации. Использовался здесь очень перспективный метод молекулярной гибридизации.
Вторая причина состоит в том, что проще выделить ген, который встречается в геноме неоднократно. Геном так сказать обогащен этим геном.
В своих работах Шпигельман также показал, что локус р-РНК в геноме кишечной палочки встречается четыре раза, в геноме Дрозофилы – порядка двухсот, у человека – несколько сотен. Т.о., природа облегчила нам задачу выделения, обогатив геном нашим локусом.
И наконец третья причина – вполне очевидная – состоит в том, что р-РНК, т.е.продукт выделяемого гена, легко может быть получен препаративно и мы можем на каждой стадии выделения контролировать процесс методом молекулярной гибридизации.
На основании вышесказанного и был выбран именно ген р-РНК.
Поскольку выводы слишком важны в теоретическом отношении, в этой работе (а как вы увидите, и в следующей тоже) очень большое внимание уделяется чистоте метода и, главное, контролю па каждом этапе выделения. Поэтому я сейчас расскажу вам работу подробно поэтапно.
1. Вначале выделялась нативная ДНК из клеток Bacillus subtills. Клетки были отобраны в экспоненциальной фазе роста, добавлением лизоцима разрушались оболочки. Добавляли додецил-сульфат натрия и проводили феноловую экстракцию и обработку РНК-азой. ДНК осаждали изопропиловым спиртом. В результате загрязнение ДНК РНК-ой было менее чем 0,5%.
2. Вторая стадия – разделение легких и тяжелых цепей ДНК. Что такое легкие и тяжелые цепи, я вам расскажу позже.
Разделение производили применением специального метода хроматографии на колонке в градиенте ионной силы. Носитель – метилированный альбумин-кизельгур (МАК).
З. Сразу после этого проводили определение способности гибридизации полученных цепей ДНК с р-РНК. И показали, что р-РНК гибридизуется только с тяжелой цепью ДНК, которая элюируется при более высокой концентрации соли. После каждого этапа определяли молекулярный вес. р-РНК была мечена тритием.
4. Выделение PНК. B культуру добавляли актиномицин-Д для подавления синтеза РНК. Поэтому и-РНК в клетке отсутствовала. Клетки отделяли от среды, подвергали лизису и обработке ДИК-азой. Из разрушенных предварительно клеток РНК осаждали холодным этанолом.
5. Выдедеиную РНК наносили иа колонку с МАК и собирали фракции р-РНК 16 и 23 сведберга. Контроль с помощью гибридизации показал, что каждая фракция р-РНК свободна от другой фракции РНК.
6. Гибридизация одноцепочечной ДНК с р-РНК. Гибридизовали обе цепи р-РНК – 16 и 23 сведберга, использовали довольно низкую температуру (37 градусов), чтобы не допустить заметной деградации ДНК. Негибридизовавшуюся РНК уничтожали РНК-азой.
7. Для удаления загрязнения ренатурированной ДНК-ой провели хроматографию на колонке оксиапатита в градиенте ионной силы. При этом была отделена одноцепочечная ДНК, в том числе и гибридизованная с р-РНК, от двухцепочечной, ренатурировавшей в процессе гибридизации.
Рисунок
8. Отделение гибрида от одноцепочечной ДНК проводили методом центрифугирования в градиенте плотиости(градиент сульфата цезия)в присутствии ионов двухвалентной ртути, Было показано, что двухвалентная ртуть более эффективно комплексирует с одноцепочочной чем с двухцепочечной ДНК. Поэтому последняя обладает меньшой плавучей плотностью.
В результате описанных выше процедур были получены частицы ДНК со средним молекулярным весом 2,4х10*6. Это чуть выше, чем ожидаемая теоретически средняя величина для обоих рибосомальных генов. Вероятно, в выделенный участок вошла не только ДНК, кодирующая непосредственно р-РНК , но и ДНК с регуляторной функцией.
Т.о., нам уже ясно, что методом гибридизации нуклеиновых кислот можно выделить достаточно определенные (как по назначению, так и по величине) участки генома. Т.е. ген мы выделили. Но если вы внимательно следили, то поняли, что описанный метод недостаточно корректен в смысле выделения индивидуального гена по двум причинам.
Во-первых, геном разбивали на куски случайным образом. В некоторые попала ДНК, кодирующая р-РНК не целиком, в то время как другие могли хватить лишнего.
Во-вторых, р-РНК является первичным продуктом гена, т.е. в данное случае мы не имеем дело с признаком в классическом смысле.
В следующей работе эти два источника некорректности исключены. Это работа J. Shapiro et al., «Isolation of Pure Lac Operon DNA», Nature, 224:768-773, 1969.
Lac-оперон – это по крайней мере шесть независимых участков, из которых три регуляторные и три структурные.
___I P ___ O Z Y X ___
I – regulatore
регуляторные P – promotore
O – opeгatore
Z – beta-galactosidase
структурные Y – galactosidpermease
X – thyogalactosidpermease
Все, кроме первого, тесно сцеплены. Регулятор отделен небольшим промежутком.
В разбираемой работе в качестве задачи было поставлено выделение гена бета-галактоозидазы, в нашем обозначении гена «Z».При этом фен, соответствующе в фенотипе донному гену – это способность организма кишечной палочки) сбраживать лактозу (точнее, осуществлять первую из трех стадии этого процесса).
Использовали более корректный способ выделения гена, с применением специфической фаговой трансдукции, причем двумя различными фагами. Для того, чтобы понять, как проводилось выделение, необходимо вспомнить некоторые явления молекулярной генетики. Вы это конечно хорошо знаете, но все же напомнить следует.
1. Механизм Кэмпбелла. По этому механизму происходит инкорпорация ДНК фага в геном бактерии, с образованием лизогенной клетки. При лизогении профаг таким же образом выходит из хромосомы, причем он может случайным образом захватить часть генетического материала хозяина. И, следовательно, монет трансдуцировать захваченные гены в другую клетку. Фаги, локализующиеся в определенном месте хромосом (а таких большинство), осуществляют специфическую трансдукцию, т. е, переносят с высокой вероятностью те гены, которые расположены близко к локусу профага па генетической карте бактерии,
2. Из двух цепей ДНК только одна является кодирующей, Вторая – замыкающая – практически не несет генетической информации в том смысле, что ока не может синтезировать РНК. Поскольку открывателей двойной опирали тоже двое, кодирующую назвали Уотсон-цепью, замыкающую – Крик-цепью. Считывание в геноме всегда идет от 5’ к 3’ концу. По направлению оперона на генетической карте можно установить, какая из цепей Уотсон и какая – Крик. В различных генах они могут меняться,
3. В двухцепочечных фрагментах количество пуринов строго равно количеству пиримидинов. В длинных одноцепочечных фрагментах соотношение пуринов и пиримидинов статистически усредняется, Но чем одноцепочечный фрагмент короче, тем больше вероятность того, что одна из цепей – кодирующая или замыкающая – будет содержать больше пуринов и окажется тяжелее другой, Используя этот факт, для коротких отрезков можно производить разделение комплементарных цепей на кодирующие и замыкающие.
На основании всего, что я вам рассказала, можно придумать логически красивый метод выделения гена, Для этого необходимо найти два фага, удовлетворяющие следующим требованиям.
1, Фаги должны инкорпорироваться в хромосому хозяина антисимметрично относительно друг друга.
2. Они не должны содержать комплементирующих последовательностей в своих геномах.
3. Профаги локализуются радом с одним и тем же геном (в нашем случае это лактозный оперон).
Тогда мы можем выделять трансдуцирующие фаги, несущие данный ген хозяина, денатурировать их ДНК, произвести разделение цепей на легкие и тяжелые. Можно заметить, что исследуемый ген бактерии будет иметь кодирующую цепь в одном фаге и замыкающую в другом в одной и той же, например, тяжелой, цепи. Остались два этапа – гибридизация тяжелых цепей различных фагов, причем поскольку последние не имеют комплементирующих последовательностей, образуются только гетеродуплексы по генетическому материалу хозяина; и применение экэонуклеазы, отстригающей негибридизованные одноцепочечные хвосты. Это логическая основа работы.
Как было указано выше, выделяли гены локуса lac Escherichia coli. Причем был выделен ген бета-галактозидаэы («Z») – фермента, обеспечивающего первую стадию сбраживания лактозы, также локусы оператора («O») и промотора(«P»), управляющие транскрипцией. Все три тесно оцеплены.
Можно подсчитать среднюю возможную длину выделяемого участка, зная молекулярный вес белковых продуктов и пересчитав его на число оснований. Длина должна быть не менее 1,0 нм (ген «Z»)и не более 1,6 нм (гены IOPZY).
Сейчас мы разберем последовательно, как было произведено выделение.
1. Были найдены фаги, удовлетворяющие трем приведенным условиям – plac5 & 80plac1. Первый встраивается в одну цепь с кодирующей локуса lac, второй – наоборот. Для обоих точка инкорпорации строго картируется, следовательно, оба могут осуществлять специфическую трансдукцию. К сожалению, профаг пси-80 локализуется достаточно далеко от lac .Эта трудность была обойдена следующим образом – была получена делеция, захватывающая всю область между локусом lac и профагом пси-80, начиная где-то с середины гена «Y». Часть генов бактерии была делетирована и с другой стороны оперона, где-то до середины гена «I».
Кроме того, про фаги пси-80 и лямбда известно, что они не имеют комплементирующих последовательностей в геномах.
Т.о., последний факт, а также полученные делении создают нам уверенную гарантию, что в выделенных ДНК фагов кроме генов локуса lac комлементарных последовательностей не будет. Причем фаги несут lac в антисимметричной ориентации относительно легких и тяжелых цепей.
2. Следующий этап – денатурация ДНК фагов и разделение легких и тяжелых цепей в градиенте плотности. Затем произведен контрольный эксперимент по гибридизации с меченой Н*3 masenger-lac-RNA. Как и следовало ожидать, гибридизовали тяжелые цепи пси-80 и легкие – лямбда. Именно они и несли смысловые (кодирующие) цепи генов оперена.
3, Следующий этап – гибридизация. Для этого были взяты тяжелые цепи обоих фагов.
Повторю еще раз. Тяжелая цепь пси-80 несла смысловую последовательность генов lac, причем целиком – интактные локусы OPZ и возможно еще кусочки от I&Y. Тяжелая цепь лямбда-фага несла замыкающую последовательность генов оперона возможно еще часть генетического материала хозяина.
В результате гибридизации получены короткие гетеродуплексные участки с четырьмя однонитчатыми хвостами. Можно подсчитать (измерить) длину гетеродуплексов под электронным микроскопом, что и было проделано. Она составляло 1, 4 мкм.
Рисунок.
4. Далее шла обработка экзонуклеазой Neurospora. Фермент съедает однонитчатые хвосты, не действуя на гетеродуплексныо участки.
Длина выделенных участков двойной опирали ДНК, измеренная под электронным микроскопом, составляла 1,3 - 1, 4 мкм.
Т.о. ген, контролирующий первую стадию сбраживания лактозы выделен. Ниточка, которую вы монете видеть на фотографии, – это не просто кусок ДНК, каких мы видели уже много. В данном случае этот кусок ДНК несет ГЕН, кодирующий определенный ФЕН в фенотипе бактерии - способность сбраживать лактозу.
Следующее звено логической цепи – ввести выделенный кусок ДНК в бесклеточную систему синтеза белка и получить фермент и соответствующую ему функцию – бета-галактозидазную активность. Это и было проделано, но уже в другой работе.
Т.е. выделенный ген не утратил соответствующий ему в фенотипе бактерии признак, пройдя огонь, воду и медные трубы выделения.
Теперь нам остается произвести теоретическое обобщение. Вспомним то, что я вам рассказывала в своей докладе на семинаре по дарвинизму.
Конечная цель науки – построение Единой Картины Мира как Отражения Окружающей Природы в Обобщенном Мозгу Человека.
ОМЧ: ОП – ЕКМ.
Отражение строится как совокупность Теорий, объясняющих явления природы. Построение отдельных теорий производится формальным методом Альтернативных Моделей. Для каждого явления природы строится полное множество Альтернативных Моделей. которые способны это явление объяснить. Затем по проведении дополнительного эксперимента выбирается та модель, которая интерпретируется на реальную природу. Теперь эта Модель уже является Теорией – составной частью ЕКМ. Пример использования метода Альтернативных Моделей содержится в моей курсовой работе.
Каждая наука строит отражение своей области природы. И каждая проходит в своей развитии три периода. Первый – т.н. «младенческий», или период свободного поиска. Это пассивное коллекционирование фактов, без их накопления не будет формального теоретического обобщения. Второй – период зрелости науки, когда последняя допускает формализацию. Условий формализации по крайней мере два – каждое понятие должно иметь строгое определение и при построении используется формальный Метод Альтернативных Моделей.
То, что некоторая наука допускает формализацию, означает, что соответствующая ей часть ЕКМ кокет быть в.целом построена. Но на этой история науки не заканчивается – следует период детализации построенного отражения (третий).
Необходимо заметить, что принципы построения ЕКМ здесь изложены очень нестрого. Интересующиеся должны заняться математической логикой (см., например, книгу Новикова),
На современном этапе очень мало наук допускают теоретическое формальное обобщение. Такими являются некоторые .физические – теормех, статфизика и др. - и одна область биологии – Генетика. Большинство же естественных наук и ни одна из гуманитарных на современном этапе формализации не допускает. Т.о. формализм – свойство, за которое генетику ругали – является признаком ее зрелости.
Если подходить строго формально. существует по крайней мере две науки, укладывающиеся в рамки современной генетики. Они соответствуют различным подходам к изучаемому объекту.
1. Первый подход – метод Черного Ящика. Изучаемый объект, в данном живой организм, представляется в виде черного ящика. Необходима установить его внутреннюю структуру. Для этого ЧЯ подвергают различного рода воздействиям. По ответам на воздействия строится интерпретация внутренней структуры как часть ЕКМ. При этом используется, естественно, МАМ (метод альтернативных моделей). Если в нашем случае ЧЯ – живой организм, то воздействия – это различные скрещивания различаемых фенотипически ЧЯ, а ответы на воздействие – появление в потомстве тех или иных фенов. Например, скрещиваем два черных ящика и в потомстве среда кучи черных получается 1/4 белых. Для того, чтобы объяснить это и другие явления такого типа, мы вводим гипотезу о гене, как некотором факторе, определяющем развитие в фенотипе конкретного наследуемого признака. Материальный носитель гена содержится во внутренней структуре ЧЯ (организма). Для объяснения дальнейших экспериментов предполагается, что каждый ген (вернее, его материальный носитель), присутствует в клетке в двух экземплярах, что гены сгруппированы в группы сцепления, что гаметы несут по одному экземпляру гена (гипотеза чистоты гамет).
Принципиально генов должно быть не менее, чем признаков фенотипа, требующих кодирования. Совокупность генов представляет программу онтогенеза, кодирующую весь процесс развития организма с полным набором фенов, из одной-единственной клетки.
Естественно, такая программа не задается от бога и не является продуктом таинственной мистической Vis vitalis (жизненной силы). В клетке должен существовать материальный носитель программы онтогенеза. Мы сейчас не будем это подробно обсуждать, но на основании экспериментов можно установить, каким должен быть материальный носитель генетической программы, а также общую схему передачи информации от гена к фену.
Вы уже видите. что на базе первого подхода – метода ЧЯ – развился Менделизм, он же формальная, или классическая, генетика (раньше ее называли «проклятым вейсманизмом-морганизмом»).
Метод ЧЯ – чисто логический подход, оказался значительно более эффективным, чем казалось бы самый прямой путь – просто взять и посмотреть, что внутри. Этот способ по меткому названию Е.Таль обозначается как «метод младенца» (что там у куклы внутри, вата или опилки?).
Понятно, почему МЧЯ оказался более эффективным. Когда мы разламываем черный ящик, установить назначение каждой детали можно только имея на вооружении принципы организации данного устройства, полученные МЧЯ. Иначе перед нами будет просто груда частей неизвестного назначения.
На основе ММ (метода младенца) развилась молекулярная генетика.
Молекулярная генетика началась почти на век позже классической. Если рождение Менделизма мы относим к 1865 году (опубликование «Опытов над растительными гибридами»), то только в 1944 году Эвери, МакЛеод и МакКарти показали, что из всего набора веществ клетки носителем генетической информации является именно ДНК.
Затем эксперименты, которые вам, несомненно, хорошо известны – открытие двойной спирали, открытие транскрипции и трансляции, полуконсервативности редупликации и другие.
Т.о. мы взломали черный ящик и увидели двойную спираль. Она состоит из цистронов, каждый колирует определенный белок. Белок имеет двойственную природу – с одной стороны, молекула белка являет собой линейно закодированную генетическую информацию (первичная структура), а с другой – осуществляет конкретную реакцию в организме, которая является функцией линейно записанной информации и приводит к развитию соответствующего признака. Т.е.белки осуществляют перевод генетической информации в фенетическую.
Между совокупностями законов и понятий Менделизма и молекулярной генетики можно установить взаимно-однозначное соответствие.
менделизм молекулярная генетика
Ген, определяющие развитие конкретного признака в фенотипе Цистрон, кодирующий образование конкретного белка
Группы сцепления, в которые собраны гены Хромосомы – носители генетической информации в клетке
Законы Менделя наследования признаков фенотипа Законы поведения хромосом в мейозе
... ...
Принципиально мокко продолжить этот список, но мы не будем этого делать, т.к. уже видно, что каждому понятию или закону классической генетики соответствует некоторое понятие или закон молекулярной, и наоборот. Несмотря на это. объединить две науки нельзя, не нарушив строгости формализма. Чаще всего смешивают термины «ген» и «цистрон». Это неверно, т.к. ген - нечто, определяющее развитие конкретного фена, а цистрон – кусок ДНК, кодирующий конкретный белок.
На современном этапе существуют по крайней мере два несоответствия данных, полученных различными! Подходами.
1. Классический подход дает нам однонитчатость структуры, в которую связаны гены, а молекулярный указывает, что хромосома представляет собой целый клубок нитей (вероятно, уложенных латерально),
2. Как классический, так и молекулярный подходы показывают линейную упорядоченность генетического материала. Но несмотря на то, что генетическая карта хромосомы (транслокационный анализ или исследование хромосом слюнных желез) колинеарны, масштаб их может резко различаться.
Второй факт легко объяснить наличием гетерохроматина или неоткрытых генов. Первый, несмотря на то, что он несомненно противоречием не является, разрешить мы сможем лишь разгадав структуру хромосомы.
Суммируя, можно сказать, что соответствующую генетике часть ЕКМ (единой картины мира) мы строим двумя принципиально различными методами – МЧЯ («черного ящика») и ММ («метод младенца). Тот факт, что подученные независимо два отражения одной и той же части природы изоморфны, является великим триумфом современной генетики. И тем не менее, смешивать в одну кашу две прекрасные в своей логической стройности науки – Менделизм и Молекулярную генетику – не следует. Это грубая ошибка, тем более что изоморфизм пока неполный. По-видимому, он будет завершен в последнем периоде развития генетики (период детализации знаний).
И вот наконец был перекинут мост через пропасть между двумя науками. Работы по выделению гена позволили соединить два построенных отражения в одно целое. То, что вы видите на фотографии, это и ген и цистрон одновременно. Это с одной стороны материальный носитель информации, обуславливающей появление определенного признака в фенотипе бактерии - способности сбраживать лактозу, и с другой – это цистрон, кусок ДНК, кодирующий синтез конкретного Фермента – бета-галактозидазы.
Два пути, идущие параллельно, сомкнулись. Ген соответствует цистрону. Функция белка соответствует фену.
Следующая задача – ввести в генетический материал мутанта, не имеющего данного фена и, соответственно, гена, этот кусок ДНК и получить недостающий фен. Строго на организменном уровне это еще не сделано.
Необходимо сделать оговорку. Мы доказали соответствие гена цистрону для некоторого конкретного признака некоторого конкретного организма. Значит ли это, что каждому гену любого организма соответствует цистрон и наоборот, можно ли сделать из полученных данных обобщающие вывод? По-видимому, да, поскольку большинство общезначимых открытий в генетике сделано на частных модельных объектах. Но все же нельзя забывать, что индукция не обладает априорной достоверностью (в отличие от, например, дедукции).
То, что вы сегодня слышали, является логическим завершением всей генетики. К сожалению из-за недостатка моих возможностей и времени это лишь краткий конспект-указание для построения отражения, но никак не кусок ЕКМ. Тема семинара настолько важна, что было бы целесообразно каждому генетику эту проблему обдумать, хотя бы для себя. Поэтому я хочу предложить вам литературу помимо двух обсужденных работ (ссылки на них помещены в тексте).
1. Paтнер В.А. Молекулярные механизмы генетических процессов. 1972. Эта книга – лучшая существующая попытка обобщения в генетике. Она ближе всего к моему докладу.
2. Новиков. Элементы математической логики. Первое издание достать невозможно. Второе выйдет в 1973 году.
3. Уотсон Д. Двойная спираль. Выработав логические требования к материальному носителю программы, получили двойную спираль – она ведь должна обладать способностью к редупликации, и обогнали дважды Нобелевского лауреата Л.Полинга, который, придав слишком больное значение химическим данным, получил тройную спираль. Именно это важно, не следует пытаться использовать книгу как руководство для получения между делом Нобелевской премии.
4. Материалы использованной в докладе статьи Shapiro et al. кратко изложены на русском языке в статье Блеслер, Природа, N1, 1972,
5. СоId Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 1963 et 1967.
Описание универсальной машины, перерабатывающей информацию (машины Тьюринга-Поста), изложено в следующих трех источниках.
6. Пионер, (10): 70-71, 1972. Здесь примитивное изложение.
7. Turing A.M., Proc. London Math. Soc. s.2, 42: 230-265, 1937.
8, Post E.L., J.Symbolic Iogic, 1(3): 103-105, 1936.
9. Вастерова Н.Н., Курсовая работа, 1972. Здесь содержится пример применения метода альтернативных моделей.
Доклад Натальи Николаевны Вастеровой на студенческом семинаре У курса.
Куратор Сергей Васильевич Шестаков.
11.12.72
Что такое ген?
Ген – это понятие формальной генетики (менделизма), придуманное человеком для объяснения реальных событии. Мендель предложил этот термин (точнее, соответствующий ему «фактор») для объяснения результатов скрещивания гороха.
Ген – это универсальное понятие, обозначающее нечто, кодирующее наследуемые признаки. До сих пор в природе не существовало материальной единицы, воплощающей это понятие. Т.о. для каждого признака, который передается в череде поколений, придумываем некоторый фактор, существующий в клетке, и называем его геном.
При такой постановке вопроса термин «ген», хотя и введенный строго формально, многие исследователям кажется чем-то мифическим. Но к этому вопросу мы вернемся позже, когда произведем теоретическое обобщение.
А вначале я расскажу вам две работы, необходимые для того, чтобы показать строго реальное существование гена. Это работы по выделению гена.
Первая работа – W.Colli & M.Oishl, «A Procedure for Gene Purification: The Purification of the Ribosomal RNA Genes of Bacillus subtills as DNA – RNA Hybrids», J. molecular Biology, 51: 657-669, 1970.
Как вы видите по названию, авторы из огромного числа генов в геноме Bacillus subtills выбрали именно ген рибосомальной РНК. Для этого существуют три причины.
Первая причина состоит в следующем, Для р-РНК впервые был доказан тот факт, что РНК кодируется непосредственно на ДНК. Интересно, что этот факт имеет самостоятельное теоретическое значение. Получен он был в работе Шпигельмана и является прямым доказательством того, что является материальным носителем генетической информации. Использовался здесь очень перспективный метод молекулярной гибридизации.
Вторая причина состоит в том, что проще выделить ген, который встречается в геноме неоднократно. Геном так сказать обогащен этим геном.
В своих работах Шпигельман также показал, что локус р-РНК в геноме кишечной палочки встречается четыре раза, в геноме Дрозофилы – порядка двухсот, у человека – несколько сотен. Т.о., природа облегчила нам задачу выделения, обогатив геном нашим локусом.
И наконец третья причина – вполне очевидная – состоит в том, что р-РНК, т.е.продукт выделяемого гена, легко может быть получен препаративно и мы можем на каждой стадии выделения контролировать процесс методом молекулярной гибридизации.
На основании вышесказанного и был выбран именно ген р-РНК.
Поскольку выводы слишком важны в теоретическом отношении, в этой работе (а как вы увидите, и в следующей тоже) очень большое внимание уделяется чистоте метода и, главное, контролю па каждом этапе выделения. Поэтому я сейчас расскажу вам работу подробно поэтапно.
1. Вначале выделялась нативная ДНК из клеток Bacillus subtills. Клетки были отобраны в экспоненциальной фазе роста, добавлением лизоцима разрушались оболочки. Добавляли додецил-сульфат натрия и проводили феноловую экстракцию и обработку РНК-азой. ДНК осаждали изопропиловым спиртом. В результате загрязнение ДНК РНК-ой было менее чем 0,5%.
2. Вторая стадия – разделение легких и тяжелых цепей ДНК. Что такое легкие и тяжелые цепи, я вам расскажу позже.
Разделение производили применением специального метода хроматографии на колонке в градиенте ионной силы. Носитель – метилированный альбумин-кизельгур (МАК).
З. Сразу после этого проводили определение способности гибридизации полученных цепей ДНК с р-РНК. И показали, что р-РНК гибридизуется только с тяжелой цепью ДНК, которая элюируется при более высокой концентрации соли. После каждого этапа определяли молекулярный вес. р-РНК была мечена тритием.
4. Выделение PНК. B культуру добавляли актиномицин-Д для подавления синтеза РНК. Поэтому и-РНК в клетке отсутствовала. Клетки отделяли от среды, подвергали лизису и обработке ДИК-азой. Из разрушенных предварительно клеток РНК осаждали холодным этанолом.
5. Выдедеиную РНК наносили иа колонку с МАК и собирали фракции р-РНК 16 и 23 сведберга. Контроль с помощью гибридизации показал, что каждая фракция р-РНК свободна от другой фракции РНК.
6. Гибридизация одноцепочечной ДНК с р-РНК. Гибридизовали обе цепи р-РНК – 16 и 23 сведберга, использовали довольно низкую температуру (37 градусов), чтобы не допустить заметной деградации ДНК. Негибридизовавшуюся РНК уничтожали РНК-азой.
7. Для удаления загрязнения ренатурированной ДНК-ой провели хроматографию на колонке оксиапатита в градиенте ионной силы. При этом была отделена одноцепочечная ДНК, в том числе и гибридизованная с р-РНК, от двухцепочечной, ренатурировавшей в процессе гибридизации.
Рисунок
8. Отделение гибрида от одноцепочечной ДНК проводили методом центрифугирования в градиенте плотиости(градиент сульфата цезия)в присутствии ионов двухвалентной ртути, Было показано, что двухвалентная ртуть более эффективно комплексирует с одноцепочочной чем с двухцепочечной ДНК. Поэтому последняя обладает меньшой плавучей плотностью.
В результате описанных выше процедур были получены частицы ДНК со средним молекулярным весом 2,4х10*6. Это чуть выше, чем ожидаемая теоретически средняя величина для обоих рибосомальных генов. Вероятно, в выделенный участок вошла не только ДНК, кодирующая непосредственно р-РНК , но и ДНК с регуляторной функцией.
Т.о., нам уже ясно, что методом гибридизации нуклеиновых кислот можно выделить достаточно определенные (как по назначению, так и по величине) участки генома. Т.е. ген мы выделили. Но если вы внимательно следили, то поняли, что описанный метод недостаточно корректен в смысле выделения индивидуального гена по двум причинам.
Во-первых, геном разбивали на куски случайным образом. В некоторые попала ДНК, кодирующая р-РНК не целиком, в то время как другие могли хватить лишнего.
Во-вторых, р-РНК является первичным продуктом гена, т.е. в данное случае мы не имеем дело с признаком в классическом смысле.
В следующей работе эти два источника некорректности исключены. Это работа J. Shapiro et al., «Isolation of Pure Lac Operon DNA», Nature, 224:768-773, 1969.
Lac-оперон – это по крайней мере шесть независимых участков, из которых три регуляторные и три структурные.
___I P ___ O Z Y X ___
I – regulatore
регуляторные P – promotore
O – opeгatore
Z – beta-galactosidase
структурные Y – galactosidpermease
X – thyogalactosidpermease
Все, кроме первого, тесно сцеплены. Регулятор отделен небольшим промежутком.
В разбираемой работе в качестве задачи было поставлено выделение гена бета-галактоозидазы, в нашем обозначении гена «Z».При этом фен, соответствующе в фенотипе донному гену – это способность организма кишечной палочки) сбраживать лактозу (точнее, осуществлять первую из трех стадии этого процесса).
Использовали более корректный способ выделения гена, с применением специфической фаговой трансдукции, причем двумя различными фагами. Для того, чтобы понять, как проводилось выделение, необходимо вспомнить некоторые явления молекулярной генетики. Вы это конечно хорошо знаете, но все же напомнить следует.
1. Механизм Кэмпбелла. По этому механизму происходит инкорпорация ДНК фага в геном бактерии, с образованием лизогенной клетки. При лизогении профаг таким же образом выходит из хромосомы, причем он может случайным образом захватить часть генетического материала хозяина. И, следовательно, монет трансдуцировать захваченные гены в другую клетку. Фаги, локализующиеся в определенном месте хромосом (а таких большинство), осуществляют специфическую трансдукцию, т. е, переносят с высокой вероятностью те гены, которые расположены близко к локусу профага па генетической карте бактерии,
2. Из двух цепей ДНК только одна является кодирующей, Вторая – замыкающая – практически не несет генетической информации в том смысле, что ока не может синтезировать РНК. Поскольку открывателей двойной опирали тоже двое, кодирующую назвали Уотсон-цепью, замыкающую – Крик-цепью. Считывание в геноме всегда идет от 5’ к 3’ концу. По направлению оперона на генетической карте можно установить, какая из цепей Уотсон и какая – Крик. В различных генах они могут меняться,
3. В двухцепочечных фрагментах количество пуринов строго равно количеству пиримидинов. В длинных одноцепочечных фрагментах соотношение пуринов и пиримидинов статистически усредняется, Но чем одноцепочечный фрагмент короче, тем больше вероятность того, что одна из цепей – кодирующая или замыкающая – будет содержать больше пуринов и окажется тяжелее другой, Используя этот факт, для коротких отрезков можно производить разделение комплементарных цепей на кодирующие и замыкающие.
На основании всего, что я вам рассказала, можно придумать логически красивый метод выделения гена, Для этого необходимо найти два фага, удовлетворяющие следующим требованиям.
1, Фаги должны инкорпорироваться в хромосому хозяина антисимметрично относительно друг друга.
2. Они не должны содержать комплементирующих последовательностей в своих геномах.
3. Профаги локализуются радом с одним и тем же геном (в нашем случае это лактозный оперон).
Тогда мы можем выделять трансдуцирующие фаги, несущие данный ген хозяина, денатурировать их ДНК, произвести разделение цепей на легкие и тяжелые. Можно заметить, что исследуемый ген бактерии будет иметь кодирующую цепь в одном фаге и замыкающую в другом в одной и той же, например, тяжелой, цепи. Остались два этапа – гибридизация тяжелых цепей различных фагов, причем поскольку последние не имеют комплементирующих последовательностей, образуются только гетеродуплексы по генетическому материалу хозяина; и применение экэонуклеазы, отстригающей негибридизованные одноцепочечные хвосты. Это логическая основа работы.
Как было указано выше, выделяли гены локуса lac Escherichia coli. Причем был выделен ген бета-галактозидаэы («Z») – фермента, обеспечивающего первую стадию сбраживания лактозы, также локусы оператора («O») и промотора(«P»), управляющие транскрипцией. Все три тесно оцеплены.
Можно подсчитать среднюю возможную длину выделяемого участка, зная молекулярный вес белковых продуктов и пересчитав его на число оснований. Длина должна быть не менее 1,0 нм (ген «Z»)и не более 1,6 нм (гены IOPZY).
Сейчас мы разберем последовательно, как было произведено выделение.
1. Были найдены фаги, удовлетворяющие трем приведенным условиям – plac5 & 80plac1. Первый встраивается в одну цепь с кодирующей локуса lac, второй – наоборот. Для обоих точка инкорпорации строго картируется, следовательно, оба могут осуществлять специфическую трансдукцию. К сожалению, профаг пси-80 локализуется достаточно далеко от lac .Эта трудность была обойдена следующим образом – была получена делеция, захватывающая всю область между локусом lac и профагом пси-80, начиная где-то с середины гена «Y». Часть генов бактерии была делетирована и с другой стороны оперона, где-то до середины гена «I».
Кроме того, про фаги пси-80 и лямбда известно, что они не имеют комплементирующих последовательностей в геномах.
Т.о., последний факт, а также полученные делении создают нам уверенную гарантию, что в выделенных ДНК фагов кроме генов локуса lac комлементарных последовательностей не будет. Причем фаги несут lac в антисимметричной ориентации относительно легких и тяжелых цепей.
2. Следующий этап – денатурация ДНК фагов и разделение легких и тяжелых цепей в градиенте плотности. Затем произведен контрольный эксперимент по гибридизации с меченой Н*3 masenger-lac-RNA. Как и следовало ожидать, гибридизовали тяжелые цепи пси-80 и легкие – лямбда. Именно они и несли смысловые (кодирующие) цепи генов оперена.
3, Следующий этап – гибридизация. Для этого были взяты тяжелые цепи обоих фагов.
Повторю еще раз. Тяжелая цепь пси-80 несла смысловую последовательность генов lac, причем целиком – интактные локусы OPZ и возможно еще кусочки от I&Y. Тяжелая цепь лямбда-фага несла замыкающую последовательность генов оперона возможно еще часть генетического материала хозяина.
В результате гибридизации получены короткие гетеродуплексные участки с четырьмя однонитчатыми хвостами. Можно подсчитать (измерить) длину гетеродуплексов под электронным микроскопом, что и было проделано. Она составляло 1, 4 мкм.
Рисунок.
4. Далее шла обработка экзонуклеазой Neurospora. Фермент съедает однонитчатые хвосты, не действуя на гетеродуплексныо участки.
Длина выделенных участков двойной опирали ДНК, измеренная под электронным микроскопом, составляла 1,3 - 1, 4 мкм.
Т.о. ген, контролирующий первую стадию сбраживания лактозы выделен. Ниточка, которую вы монете видеть на фотографии, – это не просто кусок ДНК, каких мы видели уже много. В данном случае этот кусок ДНК несет ГЕН, кодирующий определенный ФЕН в фенотипе бактерии - способность сбраживать лактозу.
Следующее звено логической цепи – ввести выделенный кусок ДНК в бесклеточную систему синтеза белка и получить фермент и соответствующую ему функцию – бета-галактозидазную активность. Это и было проделано, но уже в другой работе.
Т.е. выделенный ген не утратил соответствующий ему в фенотипе бактерии признак, пройдя огонь, воду и медные трубы выделения.
Теперь нам остается произвести теоретическое обобщение. Вспомним то, что я вам рассказывала в своей докладе на семинаре по дарвинизму.
Конечная цель науки – построение Единой Картины Мира как Отражения Окружающей Природы в Обобщенном Мозгу Человека.
ОМЧ: ОП – ЕКМ.
Отражение строится как совокупность Теорий, объясняющих явления природы. Построение отдельных теорий производится формальным методом Альтернативных Моделей. Для каждого явления природы строится полное множество Альтернативных Моделей. которые способны это явление объяснить. Затем по проведении дополнительного эксперимента выбирается та модель, которая интерпретируется на реальную природу. Теперь эта Модель уже является Теорией – составной частью ЕКМ. Пример использования метода Альтернативных Моделей содержится в моей курсовой работе.
Каждая наука строит отражение своей области природы. И каждая проходит в своей развитии три периода. Первый – т.н. «младенческий», или период свободного поиска. Это пассивное коллекционирование фактов, без их накопления не будет формального теоретического обобщения. Второй – период зрелости науки, когда последняя допускает формализацию. Условий формализации по крайней мере два – каждое понятие должно иметь строгое определение и при построении используется формальный Метод Альтернативных Моделей.
То, что некоторая наука допускает формализацию, означает, что соответствующая ей часть ЕКМ кокет быть в.целом построена. Но на этой история науки не заканчивается – следует период детализации построенного отражения (третий).
Необходимо заметить, что принципы построения ЕКМ здесь изложены очень нестрого. Интересующиеся должны заняться математической логикой (см., например, книгу Новикова),
На современном этапе очень мало наук допускают теоретическое формальное обобщение. Такими являются некоторые .физические – теормех, статфизика и др. - и одна область биологии – Генетика. Большинство же естественных наук и ни одна из гуманитарных на современном этапе формализации не допускает. Т.о. формализм – свойство, за которое генетику ругали – является признаком ее зрелости.
Если подходить строго формально. существует по крайней мере две науки, укладывающиеся в рамки современной генетики. Они соответствуют различным подходам к изучаемому объекту.
1. Первый подход – метод Черного Ящика. Изучаемый объект, в данном живой организм, представляется в виде черного ящика. Необходима установить его внутреннюю структуру. Для этого ЧЯ подвергают различного рода воздействиям. По ответам на воздействия строится интерпретация внутренней структуры как часть ЕКМ. При этом используется, естественно, МАМ (метод альтернативных моделей). Если в нашем случае ЧЯ – живой организм, то воздействия – это различные скрещивания различаемых фенотипически ЧЯ, а ответы на воздействие – появление в потомстве тех или иных фенов. Например, скрещиваем два черных ящика и в потомстве среда кучи черных получается 1/4 белых. Для того, чтобы объяснить это и другие явления такого типа, мы вводим гипотезу о гене, как некотором факторе, определяющем развитие в фенотипе конкретного наследуемого признака. Материальный носитель гена содержится во внутренней структуре ЧЯ (организма). Для объяснения дальнейших экспериментов предполагается, что каждый ген (вернее, его материальный носитель), присутствует в клетке в двух экземплярах, что гены сгруппированы в группы сцепления, что гаметы несут по одному экземпляру гена (гипотеза чистоты гамет).
Принципиально генов должно быть не менее, чем признаков фенотипа, требующих кодирования. Совокупность генов представляет программу онтогенеза, кодирующую весь процесс развития организма с полным набором фенов, из одной-единственной клетки.
Естественно, такая программа не задается от бога и не является продуктом таинственной мистической Vis vitalis (жизненной силы). В клетке должен существовать материальный носитель программы онтогенеза. Мы сейчас не будем это подробно обсуждать, но на основании экспериментов можно установить, каким должен быть материальный носитель генетической программы, а также общую схему передачи информации от гена к фену.
Вы уже видите. что на базе первого подхода – метода ЧЯ – развился Менделизм, он же формальная, или классическая, генетика (раньше ее называли «проклятым вейсманизмом-морганизмом»).
Метод ЧЯ – чисто логический подход, оказался значительно более эффективным, чем казалось бы самый прямой путь – просто взять и посмотреть, что внутри. Этот способ по меткому названию Е.Таль обозначается как «метод младенца» (что там у куклы внутри, вата или опилки?).
Понятно, почему МЧЯ оказался более эффективным. Когда мы разламываем черный ящик, установить назначение каждой детали можно только имея на вооружении принципы организации данного устройства, полученные МЧЯ. Иначе перед нами будет просто груда частей неизвестного назначения.
На основе ММ (метода младенца) развилась молекулярная генетика.
Молекулярная генетика началась почти на век позже классической. Если рождение Менделизма мы относим к 1865 году (опубликование «Опытов над растительными гибридами»), то только в 1944 году Эвери, МакЛеод и МакКарти показали, что из всего набора веществ клетки носителем генетической информации является именно ДНК.
Затем эксперименты, которые вам, несомненно, хорошо известны – открытие двойной спирали, открытие транскрипции и трансляции, полуконсервативности редупликации и другие.
Т.о. мы взломали черный ящик и увидели двойную спираль. Она состоит из цистронов, каждый колирует определенный белок. Белок имеет двойственную природу – с одной стороны, молекула белка являет собой линейно закодированную генетическую информацию (первичная структура), а с другой – осуществляет конкретную реакцию в организме, которая является функцией линейно записанной информации и приводит к развитию соответствующего признака. Т.е.белки осуществляют перевод генетической информации в фенетическую.
Между совокупностями законов и понятий Менделизма и молекулярной генетики можно установить взаимно-однозначное соответствие.
менделизм молекулярная генетика
Ген, определяющие развитие конкретного признака в фенотипе Цистрон, кодирующий образование конкретного белка
Группы сцепления, в которые собраны гены Хромосомы – носители генетической информации в клетке
Законы Менделя наследования признаков фенотипа Законы поведения хромосом в мейозе
... ...
Принципиально мокко продолжить этот список, но мы не будем этого делать, т.к. уже видно, что каждому понятию или закону классической генетики соответствует некоторое понятие или закон молекулярной, и наоборот. Несмотря на это. объединить две науки нельзя, не нарушив строгости формализма. Чаще всего смешивают термины «ген» и «цистрон». Это неверно, т.к. ген - нечто, определяющее развитие конкретного фена, а цистрон – кусок ДНК, кодирующий конкретный белок.
На современном этапе существуют по крайней мере два несоответствия данных, полученных различными! Подходами.
1. Классический подход дает нам однонитчатость структуры, в которую связаны гены, а молекулярный указывает, что хромосома представляет собой целый клубок нитей (вероятно, уложенных латерально),
2. Как классический, так и молекулярный подходы показывают линейную упорядоченность генетического материала. Но несмотря на то, что генетическая карта хромосомы (транслокационный анализ или исследование хромосом слюнных желез) колинеарны, масштаб их может резко различаться.
Второй факт легко объяснить наличием гетерохроматина или неоткрытых генов. Первый, несмотря на то, что он несомненно противоречием не является, разрешить мы сможем лишь разгадав структуру хромосомы.
Суммируя, можно сказать, что соответствующую генетике часть ЕКМ (единой картины мира) мы строим двумя принципиально различными методами – МЧЯ («черного ящика») и ММ («метод младенца). Тот факт, что подученные независимо два отражения одной и той же части природы изоморфны, является великим триумфом современной генетики. И тем не менее, смешивать в одну кашу две прекрасные в своей логической стройности науки – Менделизм и Молекулярную генетику – не следует. Это грубая ошибка, тем более что изоморфизм пока неполный. По-видимому, он будет завершен в последнем периоде развития генетики (период детализации знаний).
И вот наконец был перекинут мост через пропасть между двумя науками. Работы по выделению гена позволили соединить два построенных отражения в одно целое. То, что вы видите на фотографии, это и ген и цистрон одновременно. Это с одной стороны материальный носитель информации, обуславливающей появление определенного признака в фенотипе бактерии - способности сбраживать лактозу, и с другой – это цистрон, кусок ДНК, кодирующий синтез конкретного Фермента – бета-галактозидазы.
Два пути, идущие параллельно, сомкнулись. Ген соответствует цистрону. Функция белка соответствует фену.
Следующая задача – ввести в генетический материал мутанта, не имеющего данного фена и, соответственно, гена, этот кусок ДНК и получить недостающий фен. Строго на организменном уровне это еще не сделано.
Необходимо сделать оговорку. Мы доказали соответствие гена цистрону для некоторого конкретного признака некоторого конкретного организма. Значит ли это, что каждому гену любого организма соответствует цистрон и наоборот, можно ли сделать из полученных данных обобщающие вывод? По-видимому, да, поскольку большинство общезначимых открытий в генетике сделано на частных модельных объектах. Но все же нельзя забывать, что индукция не обладает априорной достоверностью (в отличие от, например, дедукции).
То, что вы сегодня слышали, является логическим завершением всей генетики. К сожалению из-за недостатка моих возможностей и времени это лишь краткий конспект-указание для построения отражения, но никак не кусок ЕКМ. Тема семинара настолько важна, что было бы целесообразно каждому генетику эту проблему обдумать, хотя бы для себя. Поэтому я хочу предложить вам литературу помимо двух обсужденных работ (ссылки на них помещены в тексте).
1. Paтнер В.А. Молекулярные механизмы генетических процессов. 1972. Эта книга – лучшая существующая попытка обобщения в генетике. Она ближе всего к моему докладу.
2. Новиков. Элементы математической логики. Первое издание достать невозможно. Второе выйдет в 1973 году.
3. Уотсон Д. Двойная спираль. Выработав логические требования к материальному носителю программы, получили двойную спираль – она ведь должна обладать способностью к редупликации, и обогнали дважды Нобелевского лауреата Л.Полинга, который, придав слишком больное значение химическим данным, получил тройную спираль. Именно это важно, не следует пытаться использовать книгу как руководство для получения между делом Нобелевской премии.
4. Материалы использованной в докладе статьи Shapiro et al. кратко изложены на русском языке в статье Блеслер, Природа, N1, 1972,
5. СоId Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 1963 et 1967.
Описание универсальной машины, перерабатывающей информацию (машины Тьюринга-Поста), изложено в следующих трех источниках.
6. Пионер, (10): 70-71, 1972. Здесь примитивное изложение.
7. Turing A.M., Proc. London Math. Soc. s.2, 42: 230-265, 1937.
8, Post E.L., J.Symbolic Iogic, 1(3): 103-105, 1936.
9. Вастерова Н.Н., Курсовая работа, 1972. Здесь содержится пример применения метода альтернативных моделей.
Запись сделана с помощью m.livejournal.com.